硝酸还原酶（NR，EC 1.7.1.3）是一种氧化还原酶，可催化硝酸离子还原成亚硝酸离子的反应。广泛存在于高等植物、藻类、真菌及细菌中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。硝酸还原酶位于细胞质内或细胞膜外，在硝酸盐还原途径中是限速因子，使硝酸盐转换成亚硝酸盐。本试剂盒提供了一种简单的比色法来检测生物样本中硝酸还原酶活性。其原理是NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与磺胺及N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在540nm有大吸收峰，测定其吸光值，可以反映NR活性。

自备耗材

酶标仪或可见光分光光度计（能测 540nm处的吸光值）及恒温培养箱

96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

去离子水

匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

诱导剂应用液的配制：使用时将诱导剂储备液稀释10倍，即按取1mL诱导剂储备液加9mL蒸馏水的比例，充分混匀。

提取液：即用型； 4℃保存。

试剂一：即用型；使用前平衡到室温；-20℃保存。

试剂二：临用前每瓶加 2mL提取液溶解，现配现用，溶解后的试剂，分装，-20℃保存。

试剂三：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；避光 4℃保存。

试剂四：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；避光 4℃保存。

标准曲线设置：取10µL NaNO₂ 标准品（1M）用 990µL 提取液稀释至10mM NaNO₂。取10µL 10mM 的NaNO₂ 用 990µL 提取液稀释至100µM NaNO₂。用100µM NaNO₂按下表所示，进行下一步稀释：

注意：标准品现配现用；稀释后的标准溶液不稳定，必须在4小时内使用。

样本制备

植物组织样品的前处理:

（1）取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干。

（2）称取约0.1g组织，加入1mL预冷的提取液，冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

注意：使用新鲜没有冷冻过的样本。一般不要诱导处理，预测定结果没有活性（A_测定≤A_对照）则需要诱导处理。

细菌或真菌的前处理：

先收集500万细菌或真菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL预冷的提取液，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

注意：样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融。

如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒，进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见光分光光度计去离子水调零。

2. 样本测定（在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加样）：

1. 充分混匀，室温孵育20min，测定540nm处的吸光值A。计算ΔA_测=A_测定-A_对照、ΔA_标=A_标准-A_空白。空白管只需做1管。每个测定孔设一个对照孔。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本测定没有活性（A_测定≤A_对照）则需要诱导处理，诱导处理后的样本对照孔中试剂二改成加25μL去离子水。如果样本吸光值大于1.2，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

1. 标准曲线的绘制

以标准溶液浓度为y轴，ΔA_标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将样本的ΔA_测代入方程得到y值（1μM=1μmol/L=1nmol/mL）。

2. NR活性计算：

（1）按样本鲜重计算：

单位定义：每g鲜重样品在反应体系中每分钟催化产生1nmol NO2ˉ的量为一个NR活力单位。

NR（U/g 鲜重）=y×V_反总÷(V_样÷V_样总×W)÷T=0.2y÷W

（2）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生 1nmol NO2ˉ的量为一个 NR活力单位。

NR（U/mg prot）=y×V_反总÷(V_样×Cpr)÷T=0.2y÷Cpr

（3）按细胞数量计算：

单位定义：每10⁴个细胞在反应体系中每分钟催化产生 1nmol NO2ˉ的量为一个 NR活力单位。

NR（U/10⁴ Cells）=y×V_反总÷(V_样÷V_样总×500)÷T=0.0004y

V_反总：反应体系总体积，200μL=0.2mL；V_样：加入样本体积：0.1mL；V_样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细胞数量，5×10⁶。

结果展示

典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。

3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。

4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。

5. 
勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。