1、血样要求：脐血/外周血30ml-60ml，建议采血后4 小时内进行分离 CBMC/PBMC 操作，也可使用冻存的CBMC/PBMC，活率低于80%不建议培养。 2、种瓶数量密度：PBMC 接种量4000 万左右，起始细胞浓度200 万/ml， CBMC 接种量4000 万-6000 万，起始细胞浓度200 万-300 万/ml。 3、补液密度：补液前密度一般在150 万-400 万个细胞/ml，补液后密度在80 万-150 万个细胞/ml，补液后密度不可低于60 万个细胞/ml，补液时优先按照密 度补液，在不方便计数的情况下再考虑1:1 按照体积补液。 4 4、培养基的使用： （1）每次补液前需要将培养基在室温下自然复温。 （2）禁止将整瓶培养基放入37℃孵箱复温，否则会加速补液培养基中细胞 因子的失活。 （3）配制好的完全培养基（含细胞因子）时效较短，超过20 天不建议使用， 尤其是活化前期（前7 天）。 5、正确处理和保存血浆：离心后的血浆要确保澄清，添加血浆时需考虑抗 凝剂对血浆的稀释作用。 6、培养袋的使用：培养体积小于500ml 的时候，需要折叠培养袋再进行放 置。 7、灵活掌握补液时机：细胞扩增状态不理想时，可推迟补液时间，扩增较 快时可以提前补液，尤其注意次补液的时机。装袋后的补液体积可根据培养 时间的情况进行调整。 8、控制细胞结团：细胞装袋前，需要根据克隆团的情况充分拍散细胞。装 袋后也需每天对袋子进行拍打，揉搓肉眼观察较大的细胞团。 9、培养初期不要随意晃动培养瓶：否则活化的克隆团容易飘起来，而降低 细胞因子对细胞团的活化。 10、固定实验耗材种类和型号：需提前评估变更型号、规格对培养效果的影 响，如175 的培养瓶，细胞培养袋等。