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细胞培养基本操作流程

一、准备工作

提前将培养基、胰酶、PBS等试剂从4℃取出，恢复至室温。超净工作台紫外灭菌30分钟，操作前用75%酒精擦拭台面及双手，点燃酒精灯，全程严格遵守无菌操作规范。

二、细胞复苏

从液氮罐中取出冻存管，迅速置于37℃水浴中快速摇晃解冻（约1分钟）。解冻后加入适量完全培养基稀释，1000rpm离心5分钟，弃上清，用新鲜培养基重悬细胞，接种至培养瓶中，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。

三、细胞换液

观察培养基颜色变化，一般每2-3天换液一次。弃去旧培养基，用PBS轻轻洗涤1-2次，加入新鲜完全培养基，放回培养箱继续培养。

四、细胞传代

待细胞生长至80%-90%汇合度时进行传代。弃去培养基，PBS洗涤，加入适量胰酶消化1-2分钟，显微镜下观察细胞变圆脱落，立即加入完全培养基终止消化。轻轻吹打制成单细胞悬液，按1:2至1:3比例分装至新培养瓶。

五、细胞冻存

将对数期细胞消化收集，离心弃上清，用冻存液重悬，分装至冻存管。无需程序性降温：细胞收集→冻存液混合均匀→-80℃过夜，次日转入液氮罐长期保存。