
淀粉酶负责水解淀粉,包括α-淀粉酶(α-AL,EC 3.2.1.1)和β-淀粉酶(β-AL)。α-淀粉酶随机催化淀粉中α-1,4-糖苷键水解,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖,同时使淀粉的粘度降低,因此又称为液化酶。α-淀粉酶分布十分广泛,遍及微生物乃至高等植物。本试剂盒提供了一种简单的比色法来检测生物样本中α-淀粉酶活性,其原理是淀粉水解酶催化淀粉水解生成还原糖,还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质,在540nm有吸收峰;通过测定540nm吸光度增加速率,计算淀粉酶活性。α-淀粉酶耐热,但是β-淀粉酶在70℃下15min可钝化。因此粗酶液经过70℃钝化15min,就只有α-淀粉酶能够催化淀粉水解。



酶标仪或可见光分光光度计(能测540nm处的吸光度)
水浴锅、离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
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通常可以按比例缩小,如说明书中是约0.1g组织加1ml提取液,可以等比例缩小,如0.05g组织加0.5ml提取液提取。后续操作不变。此外,对于数量少、酶活性低的样品,一方面可以减少提取液体积,另一方面还可以延长反应时间。
生化试剂盒初一般是采用分光光度法,用分光光度计测量吸光度。微量法是随着酶标仪和微孔板的普及,改用酶标仪和酶标板测量吸光度。除了仪器不同以外,主要差别是反应体系更小,一般不超过250ul,计算公式的系数会有一定变化。
d:由比色皿光径,1cm改为96孔板直径,0.5 cm(也有0.6cm的)
但对于标明只用分光光度法的试剂盒,不建议使用酶标仪进行酶活性测定。非要用酶标仪进行检测,一定要按照说明书将反应体系缩小至250微升左右,加样表中各试剂体积一定要按照比例缩小。不过,因为初研发时是按照分光光度法进行设计和调整的,用户改变测定仪器后,我们不保证能够取得好的结果。
1)对照的设置对于测定结果的可靠性影响很大,尤其是待测液中含有与测定原理中拟直接检测的产物一样的物质时。通过设置对照,不仅可以排除本底的影响,而且可以排除其它一些未知的复杂影响,保证测定结果可靠。
(2)首先考虑的是保证测定结果可靠。因此,有些试剂盒只设空白对照,但是有些试剂盒每个样品都设对照。其中后者是根据反应原理,为了排除可能的复杂影响。
关于设置样本对照是否造成浪费。首先必须要保证测定结果可靠,因为如果测定结果不可靠,就不可能得到正确结论,那么所有的研究投入,包括前期的样品培养与处理、购买试剂盒的费用和用户的时间与精力,都会浪费。为此,我们精心权衡,在必要时每个样品都设对照。
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