极超敏 ECL 发光底物检测试剂盒用于检测直接或间接标记辣根过氧化物酶 HRP 的抗体及其关联的抗原，是一种可广泛应用于免疫学实验的化学发光试剂。由于采用了独特的发光底物系统和高灵敏度荧光 ECL 发光试剂，极超敏 ECL 发光底物检测试剂盒是目前灵敏的商业化荧光 ECL 检测试剂之一，灵敏度高于常规超敏ECL 检测试剂数千倍乃至数万倍：
(1) 具有极高灵敏度和高信噪比，可检测 10～100ag 微量抗原；
(2) 发光迅速且稳定，荧光可使 X 光胶片感光达 12 小时以上，特别适用于痕量蛋白或核酸检测；
(3) 可使用更高的抗体稀释倍数(1:2000～1:20000) ，极其节省抗体。
(4)优异的性价比，更高的性能，更低的价格。
(1) 使用合适的方法进行 Western Blot ，直至用 PBST 洗涤二抗。注意用 HRP 标记 IgG 或用一抗-链亲和素-生物素-HRP 夹心法。
(2) Western Blot 后一次洗膜的同时新鲜配制发光工作液：分别取等体积的溶液 A 和 B ，放入干净容器中混合备用。工作液宜在临检测前配制，室温放置数小时后仍可使用但灵敏度略有降低。
(3) 用 WB 专用镊子取出膜，搭在滤纸上沥干洗液但勿使膜完全干燥。将膜置于一洁净保鲜膜上，然后使其 完全浸入新配制的发光工作液(0. 1mL 发光工作液/cm2 膜)中充分接触，室温孵育 2 分钟。孵育时间过长不会 增加灵敏度，有时还会导致曝光条带异常。发光过程的本质是酶促反应，使用过少的发光工作液不利反应进行，也会导致膜上条带曝光不均和明显的灵敏度降低，为达节约目的可将膜剪小但勿降低发光液用量。
(4) 用 WB 专用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干发光工作液，但勿洗去发光液。将膜放在两片保鲜膜中间，随后进行压片检测或化学发光成像仪检测。
(5) 压片检测：将 Western Blot 膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹 Western Blot 膜，去除气泡和皱 褶，可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。将覆盖 Western Blot 膜的保鲜膜固定在暗 盒内，蛋白带面向上。打开 X 光胶片暗盒，暗房内压 X 光胶片，分别曝光不同的时间如数秒到数分钟，然后定影显影冲洗。后根据结果再调整压片时间得到满意的压片结果。
(6) 化学发光成像仪检测：将膜放置到化学发光成像仪内，参考仪器说明书进行检测。
(1) 各溶液使用完后，请盖紧瓶盖以防失效。特别是 B 液，含有氧化剂，比较容易被还原而失效。
(2) A 液和 B 液在吸取过程中必须要更换枪头，A 液和 B 液相互污染后会导致 A 液和 B 液逐渐失效，影响后续的使用效果。
(3) 步骤 1～4 可在日光灯下操作；但发光液曝露于强光下时间过久灵敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。
(4) 长时间曝光或蛋白过量，将加深背景并使条带强弱变化失去线性关系；曝光不足则条带模糊。
(5) 发光工作液孵育约 2 分钟后膜上的条带发光。强条带发光在暗房中肉眼可见，低丰度蛋白条带发光较弱甚 至肉眼不可见但可使 X 光胶片曝光。不能简单以肉眼观察判断条带发光时间，肉眼不可见的荧光实际上可持续数小时并使 X 光胶片感光，因而弱带可曝光 1- 10 小时。
(6) 由于极超敏发光液极其灵敏，强烈推荐大多数进口抗体起始浓度为一抗 1:2000～1:20000 ，二抗 1:10000~1:100000 。抗体浓度过高将造成高背景或没有条带导致失败。
(7) 当发现极超敏 ECL 发光底物检测试剂盒(PMK0575)的检测灵敏度过高而影响检测结果时，可以选择检测灵敏度较低一些的特超敏 ECL 发光底物检测试剂盒(PMK003)或超敏 ECL 发光底物检测试剂盒(PMK0448)，或者减少样品、一抗或二抗的用量。
(8) 某些保鲜膜包裹印迹膜时可能会淬灭荧光，应选择高质量保鲜膜。尽量使用 WB 专用镊子或者塑料镊子，金属镊子可能会造成淬灭荧光。
(9) NaN3 能抑制 HRP 活性，因此缓冲液中应避免使用 NaN3 做为防腐剂，如必需使用勿超过 0.01%。
(10) 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
(11) 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作，且戴手套可以避免在印记膜上留下手印。
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答：可能的原因有：
1、目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带，建议查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小；
2、样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作；
3、杂蛋白多，建议处理目的蛋白；
4、抗体特异性不强，建议使用特异性强的抗体；
5、抗体孵育时间过久，建议减少抗体孵育时间；
6、二抗与抗原有交叉反应，建议选择合适的封闭物；
7、二聚体或多聚体存在，建议增加蛋白质变性过程及强度；
8、底物显色与曝光时间过长，建议缩短显色及曝光的时间。
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