答：如果能够排除下面的几个问题，那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

1、二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；

2、ECL底物中H2O2不稳定，失活；

3、ECL底物没覆盖到相应位置；

4、一抗选择不当；

5、二抗失活。

答：可能的原因有：

1、膜没有完全均匀湿透,建议 使用100% methanol浸透膜；

2、洗膜不充分，可以增加洗液体积和洗涤次数；

3、电极不平衡或者加样位置偏斜，可以调整电极和加样；

4、封闭物用量不足，可以提高封闭物浓度，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜；

5、封闭物使用不当，比如检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭；

6、封闭时间不够，一般情况下室温37度封闭1小时以上或者4度封闭过夜；

7、抗体非特异性结合，可以降低抗体浓度，减少孵育时间；

8、一抗稀释度不适宜，可以对抗体进行滴度测试，选择适宜的抗体稀释度；

9、一抗孵育的温度偏高，建议4℃结合过夜；

10、抗体浓度过高或洗涤不够，建议降低抗体浓度，增加洗涤次数和时间；

11、化学显色底物过多，建议按说明书加入适量的显色底物。

答：可能的原因有：

1、胶凝的不均匀或聚合不好，建议灌胶前将溶液充分混匀；

2、某些样品盐浓度较高，建议除盐或将样品盐浓度调成一致；

3、缓冲液陈旧，成分改变,可以重配；

4、凝胶下面有气泡,电泳前要先将气泡赶走；

5、电泳时温度过高，可以降低电流或电压；

6、样品中含有不溶性颗粒，建议样品充分搅拌混匀。